熒光顯微鏡簡(jiǎn)介
熒光顯微鏡介紹
熒光是物質(zhì)吸收給定波長(zhǎng)的光并發(fā)射另一波長(zhǎng)的光時(shí)發(fā)生的現(xiàn)象。熒光發(fā)生于電子，該電子被激發(fā)到更高且更不穩(wěn)定的能量狀態(tài)，弛豫到其基態(tài)并發(fā)出光子。負(fù)責(zé)激發(fā)或?qū)㈦娮右苿?dòng)到更高能量狀態(tài)的光，其波長(zhǎng)和能量要比熒光發(fā)射的波長(zhǎng)和能量長(zhǎng)，而熒光發(fā)射的波長(zhǎng)更長(zhǎng)，能量更低且顏色不同。
熒光顯微鏡結(jié)合了光學(xué)顯微鏡的放大特性和熒光技術(shù)，該技術(shù)可以激發(fā)和檢測(cè)熒光團(tuán)-熒光化合物的發(fā)射。借助熒光顯微鏡，科學(xué)家可以觀察組織內(nèi)特定細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞內(nèi)分子的位置。
熒光顯微鏡的原理和組成
熒光顯微鏡的主要組成部分與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡有很大的重疊。但是，兩個(gè)主要區(qū)別是光源的類(lèi)型和專(zhuān)用濾鏡元件的使用。
熒光顯微鏡需要一個(gè)非常強(qiáng)大的光源，例如氙氣或汞弧光燈，如此處所示。水銀弧光燈發(fā)出的光的亮度是大多數(shù)白熾燈的10到100倍，并提供從紫外線到紅外線的各種波長(zhǎng)的光。此高功率光源是熒光顯微鏡設(shè)置中zui危險(xiǎn)的部分，因?yàn)橹币曃催^(guò)濾的光會(huì)嚴(yán)重?fù)p壞視網(wǎng)膜，如果燈泡處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致燈泡爆炸。
熒光顯微鏡的基本原理
熒光顯微鏡的原理很簡(jiǎn)單。當(dāng)光離開(kāi)弧光燈時(shí)，它被引導(dǎo)通過(guò)一個(gè)勵(lì)磁濾波器，該濾波器選擇激發(fā)波長(zhǎng)。
該光被稱(chēng)為二向色鏡的特殊鏡向樣品反射，該鏡被設(shè)計(jì)為僅反射激發(fā)波長(zhǎng)的光。反射光穿過(guò)物鏡，然后將其聚焦到熒光樣本上。樣品發(fā)出的光又依次通過(guò)物鏡-發(fā)生圖像放大的物鏡-現(xiàn)在通過(guò)二向色鏡。
該光被屏障過(guò)濾器過(guò)濾，屏障過(guò)濾器選擇發(fā)射波長(zhǎng)并過(guò)濾掉來(lái)自弧光燈或其他從顯微鏡組件反射回來(lái)的光源的污染光。zui終，過(guò)濾后的熒光發(fā)射被發(fā)送到檢測(cè)器，在此圖像可以被數(shù)字化，或者被傳輸?shù)侥跨R進(jìn)行光學(xué)觀察。
激發(fā)濾光片，二向色鏡和屏障濾光片可以組裝在一起，成為一個(gè)稱(chēng)為濾光片立方的組件。觀察樣品期間可以改變不同的濾光片立方體以改變激發(fā)波長(zhǎng)，并且可以使用一系列的隔膜來(lái)改變激發(fā)強(qiáng)度。
在進(jìn)行熒光顯微鏡檢查時(shí)，熒光團(tuán)與顯微鏡本身一樣重要，并且要成像的熒光團(tuán)的類(lèi)型決定了所用的激發(fā)波長(zhǎng)和所檢測(cè)到的發(fā)射波長(zhǎng)。激發(fā)波長(zhǎng)包含能被熒光團(tuán)吸收并使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)的小范圍能量。激發(fā)后，可能會(huì)產(chǎn)生大范圍的發(fā)射或轉(zhuǎn)換回較低的能量狀態(tài)，從而產(chǎn)生發(fā)射光譜。
吸收或激發(fā)曲線的峰值與發(fā)射曲線的峰值之間的差稱(chēng)為斯托克頻移。該偏移的距離越大，則將兩個(gè)不同的波長(zhǎng)分開(kāi)就越容易。此外，濾鏡立方體的組件需要去除任何重疊的光譜，以減少背景并提高圖像質(zhì)量。
熒光團(tuán)長(zhǎng)時(shí)間處于激發(fā)狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生光漂白，這是熒光減弱或丟失的原因。為了減少光漂白，您可以在幻燈片上添加防褪色安裝介質(zhì)，并用指甲油密封邊緣?；脽羝诓怀上駮r(shí)也應(yīng)保持在黑暗中。
熒光顯微鏡成像
要開(kāi)始熒光成像，請(qǐng)打開(kāi)氙氣或汞燈光源，并使其預(yù)熱15分鐘，以使其達(dá)到恒定的照明度。
接下來(lái)，將您的樣品放在舞臺(tái)上并將其固定到位。然后，打開(kāi)顯微鏡的白光源。通過(guò)調(diào)節(jié)粗調(diào)和細(xì)調(diào)旋鈕，使用zui低功率的物鏡將樣品聚焦。然后，使用舞臺(tái)調(diào)節(jié)旋鈕找到您感興趣的區(qū)域。
接下來(lái)，關(guān)閉白光源以及所有不必要的室內(nèi)燈以減少背景。
為要成像的染料選擇正確的濾鏡立方體，然后打開(kāi)快門(mén)以照亮樣品。
zui后，進(jìn)行微調(diào)焦，并將輸出光引導(dǎo)至成像相機(jī)。您可能需要調(diào)整每種使用的不同熒光團(tuán)或熒光染料的曝光時(shí)間。但是，比較不同樣品上具有相同染料的特征時(shí)，保持曝光時(shí)間恒定很重要。
要使同一樣本上的多種染料成像，請(qǐng)更改濾鏡立方體以匹配每個(gè)熒光團(tuán)并記錄新圖像。
對(duì)樣品中的每種染料成像后，可以疊加并合并各個(gè)圖像。
應(yīng)用
許多不同類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)都可以利用熒光顯微鏡檢查，并涉及不同類(lèi)型的熒光團(tuán)。熒光顯微鏡檢查的zui常見(jiàn)應(yīng)用之一是對(duì)已用與熒光化合物連接或“綴合”的抗體標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行成像。在此，使用與alexafluor-488偶聯(lián)的二抗檢測(cè)了針對(duì)鉤端螺旋體表面蛋白的抗體，該抗體在激發(fā)時(shí)發(fā)出綠色熒光。
用熒光突出顯示特定特征的另一種方法是將熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白或GFP）的代碼整合到生物體的DNA中。GFP的基因zui初是從水母中分離出來(lái)的，可以由培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)或產(chǎn)生，以響應(yīng)特定的觸發(fā)信號(hào)或作為特定細(xì)胞類(lèi)型的一部分，例如該圖像中顯示的腫瘤細(xì)胞
熒光成像的另一個(gè)應(yīng)用是熒光斑點(diǎn)顯微鏡技術(shù)，該技術(shù)使用熒光標(biāo)記的大分子裝配體（如此處看到的F-肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)）來(lái)研究這種重要細(xì)胞骨架蛋白的運(yùn)動(dòng)和更新動(dòng)力學(xué)。
通過(guò)有意地對(duì)樣品的一小部分進(jìn)行光漂白，以監(jiān)測(cè)熒光標(biāo)記分子回到光漂白區(qū)域的擴(kuò)散速率，可以執(zhí)行一種稱(chēng)為光漂白后熒光恢復(fù)的先進(jìn)技術(shù)，即FRAP。
