熒光是物質(zhì)在受到光或其他形式的電磁輻射照射時發(fā)出光能而引起的物理效應。熒光顯微鏡是利用熒光和磷光原位或結(jié)合反射和吸收來研究有機和無機物體的光學性質(zhì)的光學顯微鏡。熒光顯微鏡有助于更清晰地觀察物體的亞細胞和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。它是在 20 世紀初由 August K?hler、Carl Reichert 和 Heinrich Lehmann 發(fā)現(xiàn)的。

文章索引（點擊跳轉(zhuǎn)）

• 熒光顯微鏡工作原理

• 熒光顯微鏡的工作

• 熒光顯微鏡的組成

• 1. 熒光團

• 2. 光源

• 3. 勵磁濾波器

• 4.分色鏡

• 5. 排放過濾器

• 熒光顯微鏡的優(yōu)點

• 熒光顯微鏡的缺點

• 熒光顯微鏡的用途

熒光顯微鏡工作原理

熒光顯微鏡的工作原理通常是用染料對樣品的成分和結(jié)構(gòu)進行染色。這是因為大多數(shù)細胞成分本質(zhì)上是無色的。因此，它們不能容易地相互區(qū)分。用短波長光或電磁射線照射的熒光團或熒光分子傾向于發(fā)光。與入射光相比，發(fā)射光具有更長的波長。通常，輻照和發(fā)射之間的持續(xù)時間以納秒為單位，可以很容易地忽略。發(fā)射的光與入射光分開，這告訴了熒光團的確切位置。樣品的圖像是基于二次光而不是基于一次入射光產(chǎn)生的。

熒光顯微鏡的工作

熒光顯微鏡的工作方式與光學顯微鏡類似。它由強光源、特殊帶通濾光片和樣品的熒光標記組成。待研究的樣品置于顯微鏡下。使波長短到足以激發(fā)熒光團的光線照射到樣品上。在物鏡的幫助下，這道光線聚焦在樣本上。樣品發(fā)出的激發(fā)射線然后通過物鏡聚焦在探測器上。激發(fā)光線的主要部分通過樣品物體傳輸，而其中一部分被反射回來并到達檢測器。

熒光顯微鏡的組成

1. 熒光團

熒光團是一種在被電磁波或光波激發(fā)時能夠發(fā)光的化合物。它也被稱為熒光染料。熒光團基本上由具有各種 π 鍵的芳香基團或平面/環(huán)狀分子的組合組成。

2. 光源

光源是熒光顯微鏡最重要的組成部分之一。在這里，用于激發(fā)的最常見光源包括激光器、大功率 LED、氙弧燈、汞蒸氣燈等。

3. 勵磁濾波器

熒光顯微鏡中使用的激發(fā)濾光片通常是帶通濾光片，它允許落入特定帶寬的信號同時拒絕所有其他信號。熒光團吸收的波長很容易通過，而反射的光輻射則被阻擋。

4.分色鏡

分色鏡充當薄膜濾光片。分色鏡的主要用途是選擇性地通過小范圍顏色的光，同時反射所有其他顏色。它也被稱為精確的彩色濾光片。

5. 排放過濾器

發(fā)射濾光片是一種帶通濾光片。發(fā)射濾光片的工作類似于激發(fā)濾光片。它通過熒光團發(fā)射的光輻射，同時阻擋激發(fā)光。 

熒光顯微鏡的優(yōu)點

1. 熒光顯微鏡的靈敏度非常高，即每立方微米大約等于 50 個分子。

2. 借助熒光顯微鏡，可以將不同的分子染上不同的顏色，從而使用戶可以同時對一種物質(zhì)的多個分子進行成像。

3.熒光顯微鏡比傳統(tǒng)光學顯微鏡效率更高。

4. 可用于體內(nèi)和體外成像。

5. 熒光顯微鏡能夠以高精度分離單個蛋白質(zhì)。

6. 熒光顯微鏡最適合成像和研究活細胞表現(xiàn)出的動態(tài)行為。

7. 熒光顯微鏡能夠產(chǎn)生高分辨率和清晰的圖像，從而加強研究。

8. 它結(jié)合了光學顯微鏡的放大特性和熒光的可視化。

9. 熒光顯微鏡可用于生成正在研究的樣品的 3D 放大圖像。

熒光顯微鏡的缺點

1. 由于稱為光漂白的過程，熒光顯微鏡中存在的熒光化合物或熒光團在受到激發(fā)時往往會隨著時間的推移失去其發(fā)光能力。當熒光團分子由于熒光期間的電子激發(fā)而受到化學損傷時，通常會發(fā)生光漂白。

2. 它只允許觀察和研究樣品中已經(jīng)突出顯示并標記為熒光的某些結(jié)構(gòu)。

3. 當熒光材料被光線照射時，熒光分子往往會產(chǎn)生化學物質(zhì)，從而進一步導致光毒性。這種光毒性效應破壞了觀察樣品的原始性質(zhì)。短波長光輻射的光毒性相對較高。

4. 熒光顯微鏡無法提供有關(guān)脂質(zhì)雙層的信息，尤其是對于 SUV。

5. 熒光顯微鏡不能產(chǎn)生任何與囊泡的雙層特征或?qū)訝钣嘘P(guān)的結(jié)論性觀察結(jié)果。

6. 探針和染料的添加往往會干擾脂質(zhì)囊泡的性質(zhì)，從而導致數(shù)據(jù)解釋不準確，從而破壞實驗的真實性。

7. 光誘導的脂質(zhì)過氧化可能導致結(jié)構(gòu)域形成。

熒光顯微鏡的用途

1. 熒光顯微鏡廣泛用于在微觀水平上以最高質(zhì)量研究樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

2. 熒光顯微鏡最適合研究活體生物樣本。

3. 在標記細胞或微生物的最內(nèi)部結(jié)構(gòu)時，通常首選這種顯微鏡。

4.有助于測量細胞或被觀察樣品的生理狀態(tài)。